第二年，大流士三世调集步骑兵10万，进至马其顿军队后方交通线上的伊苏斯，切断亚历山大南进大军的补给线和退路。亚历山大审时度势，迅速转换兵力，回兵伊苏斯，北上迎战波斯军队。两军在伊苏斯摆下大阵。波斯军队步兵居中，骑兵掩护侧翼，步兵前面有战车掩护，战车前面还有勇猛的印度象。亚历山大充分应用其娴熟的“点斜式”战术，在正面部署少量步兵，占领高地，阻住波斯主力进兵，令重骑兵从一翼冲出，形成局部优势，猛冲猛杀，打垮了波斯军队翼侧阵地的骑兵掩护部队，从背后横扫波斯步兵大阵，再迂回到波斯人阵地的另一翼。正面的马其顿重装步兵乘势反攻，与骑兵配合，前后夹击，波斯人阵形大乱，纷纷后撤，一时间人挤车、车撞马、马踏人，溃不成军，死伤无数。大流士三世在亲兵护持下，连夜奔逃几百里，才勉强保住性命。
伊苏斯大捷以后，亚历山大指挥马其顿军队扩大战果，连下叙利亚、埃及、利比亚等波斯帝国边缘省区，一直进至尼罗河西岸，在尼罗河口建立起雄伟的亚历山大城，控制了地中海。一年以后，亚历山大挥师向东，进军美索不达米亚平原，准备最后推翻波斯帝国。